熒光素酶檢測試劑盒是生物體內(nèi)催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱，可以從細(xì)菌、螢火蟲、海星等生物中提取出來。熒光素酶的這種催化底物產(chǎn)生自發(fā)熒光的特性可以靈敏地檢測基因的表達(dá)。

 

　　可分別催化各自的底物發(fā)出不同顏色的熒光，且兩種光吸收波長不同，檢測互不干擾，因此可在同一個化學(xué)反應(yīng)體系中同時使用，作為雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)使用，已成為研究轉(zhuǎn)錄因子參與基因調(diào)控的有效手段,通過對啟動子DNA片段的分析,驗證啟動子結(jié)合元件的反式激活能力,探討轉(zhuǎn)錄因子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的分子機(jī)制。

 

　　熒光素酶檢測試劑盒實驗步驟：

　　（1）用生物信息學(xué)方法分析并預(yù)測啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（若目標(biāo)是檢測miRNA及其靶基因的靶向作用，則需要預(yù)測兩者結(jié)合位點(diǎn)）。

　　（2）設(shè)計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒（如pGL3-basic）中。

　　（3）篩選陽性克隆，測序。擴(kuò)增克隆并提純質(zhì)粒備用。

　　（4）擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄因子質(zhì)粒，提純備用。同時準(zhǔn)備相應(yīng)的空載質(zhì)粒對照，提純備用。

　　（5）培養(yǎng)293（或其它目的細(xì)胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時。

　　（6）將報告基因質(zhì)粒與轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

　　（7）質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染48h后，棄去培養(yǎng)基，用100μl1XPBS洗1遍。

　　（8）傾斜96孔板，吸干剩余的PBS。

　　（9）去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫。

　　（10）每孔加50μl稀釋好的1XPLB，搖床常溫條件下?lián)u15min，進(jìn)行裂解。

　　（11）白色不透光的96孔酶標(biāo)板中每孔加步驟（10）的上清液10μl，加入100μl預(yù)先混好的LARII，2s后測數(shù)據(jù)。

　　（12）每孔添加100μl預(yù)先混好的Stop&GloReagent，靜止2s后，測數(shù)據(jù)。